Diagnóstico molecular de infecção por Leishmania (Leishmania) chagasi em soro de cães domésticos e animais silvestres provenientes de área endêmica de leishmaniose visceral no estado do Pará
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Data
2025-06-27
Autor
HABER, Giovanna Zandonadi
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Editor
Universidade do Estado do Pará
Resumo em português
A Leishmaniose Visceral (LV), classificada como uma Doença Tropical Negligenciada, configura-se como um grave problema de saúde pública, intimamente associado à pobreza e às precárias condições sanitárias. Transmitida por flebotomíneos e tendo como hospedeiros vertebrados, além dos seres humanos, cães e animais silvestres, seu diagnóstico demanda a utilização de métodos laboratoriais precisos, essenciais para a realização de um tratamento eficaz. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo diagnosticar molecularmente a infecção por Leishmania (L.) chagasi em amostras de soro de cães e animais silvestres no estado do Pará, por meio da aplicação dos testes de ELISA -indireto-, para detecção de IgG, e da qPCR. Foram analisadas 85 amostras, sendo 60 provenientes de cães e 25 de animais silvestres, coletadas, tanto em áreas endêmicas (Barcarena/PA), quanto em áreas não endêmicas (Região Metropolitana de Belém/PA). O ELISA - indireto foi realizado utilizando antígenos previamente padronizados, enquanto, na qPCR, foram empregados primers e uma sonda, direcionados à região do kDNA do minicírculo do parasito. A padronização da extração de DNA e da qPCR foi bem-sucedida, com reprodutibilidade e limite de detecção (LOD) do ensaio em aproximadamente Cq=34. A concentração ideal de reagentes foi definida como 500 nM para primers e 200nM para a sonda e diluição do controle positivo foi de 1/106. O ensaio demonstrou alta sensibilidade de 100%, eficiência de 110,4% e R² de 0,996. No entanto, foram observadas limitações na especificidade (2,17%) atribuídas à posição inadequada da sonda TaqMan®- MGB e à presença de SNPs, o que gerou reações cruzadas com o controle negativo e outras espécies de Leishmania e Trypanosoma. Além disso, a comparação com o ELISA-indireto revelou concordância quase nula entre os métodos, devido as diferenças metodológicas. Diante disso, foi desenvolvido um novo conjunto de oligonucleotídeos (conjunto GIO), com base na região do minicírculo do kDNA, visando maior especificidade. E apesar das limitações observadas quanto à especificidade, o método demonstrou potencial para detectar infecções mesmo em amostras com baixas cargas parasitárias, ressaltando, assim, a necessidade de aperfeiçoamento dos oligonucleotídeos empregados.
Resumo em língua inglesa
Visceral Leishmaniasis (VL), classified as a neglected tropical disease, represents a serious public health concern closely linked to poverty and poor sanitary conditions. Transmitted by phlebotomine sandflies and having as vertebrate hosts not only humans but also dogs and wild animals, its diagnosis requires precise laboratory methods, which are essential for effective treatment. In this context, the present study aimed to molecularly diagnose Leishmania (L.) chagasi infection in serum samples from dogs and wild animals in the state of Pará, through the application of indirect ELISA for IgG detection and qPCR. A total of 85 samples were analyzed —60 from dogs and 25 from wild animals— collected from both endemic areas (Barcarena/PA) and non-endemic areas (Metropolitan Region of Belém/PA). The indirect ELISA was performed using previously standardized antigens, while in the qPCR assay, primers and a probe were used, targeting the kDNA minicircle region of the parasite. The standardization of DNA extraction and qPCR was successful, with good reproducibility and a limit of detection (LOD) at approximately Cq=34. The optimal reagent concentrations were established as 500nM for primers, 200nM for probe, and a 1/10⁶ dilution of the positive control. The assay demonstrated high sensitivity (100%), efficiency of 110.4%, and an R² value of 0.996. However, limitations in specificity (2.17%) were observed, attributed to the suboptimal positioning of the TaqMan®-MGB probe and the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs), which led to cross-reactions with the negative control and other Leishmania and Trypanosoma species. The comparison with the indirect ELISA revealed minimal agreement between the methods due to their methodological differences. In response to this, a new set of oligonucleotides (designated the GIO set) was developed, targeting the kDNA minicircle region to improve specificity. Despite the specificity limitations, the method showed potential to detect infections even in samples with low parasite loads, highlighting the need for further refinement of the oligonucleotides used.
Resumo em outro idioma
Palavras-chave em português
Palavras-chave
Leishmaniose Viscera, Biologia Molecular, Diagnóstico molecular, Visceral Leishmaniasis, Molecular Biology, Molecular diagnosis
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Referência
HABER, Giovanna Zandonadi. Diagnóstico molecular de infecção por Leishmania (Leishmania) chagasi em soro de cães domésticos e animais silvestres provenientes de área endêmica de leishmaniose visceral no estado do Pará. Orientador: Patrícia Karla Santos Ramos. 2025. 107 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária na Amazônia) - Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade do Estado do Pará, Belém, 2025.